Diplômée de l’École supérieure de théâtre de l’UQAM en 1992, Isabelle Brouillette commence sa carrière sur les planches avec, notamment, le spectacle Si la tendance se maintient, écrit et mis en scène par François Archambault, dans la foulée du référendum de 1995. Elle joue ensuite dans plusieurs productions du Théâtre Momentum – L’incompréhensible vérité du maître (1999), Les artistes naturels (2001), Les laboratoires Crête (2001) et Diskotëk (2005) – sous l’égide de François Papineau, Stéphane Crête et Sylvie Moreau.

En 2017, elle incarne plusieurs rôles dans la pièce Dans la tête de Proust, où elle renoue avec sa complice Sylvie Moreau – auteure et metteure en scène de l’œuvre. La même année, le public de La Licorne a pu la voir dans Baby-sitter de Catherine Léger, sous la houlette de Philippe Lambert. À l’automne 2019, elle foule de nouveau les planches de La Licorne pour la reprise de Bonne retraite, Jocelyne, de Fabien Cloutier.

Isabelle Brouillette s’est distinguée à la télévision dans États humains (qu’elle a aussi co-écrit), Destinées, M’entends-tu?, Nuit blanche, Sortez-moi de moi, Pour toujours plus un jour, et Stat. Au cinéma, elle s’est illustrée dans le film Chocolat, crème glacée et autres consolations de Julie Hivon. Elle a également été une joueuse régulière de la LNI entre 1999 et 2009. On peut entendre ses chroniques à ICI Première à l’émission Pénélope, dans le joyeux duo qu’elle forme avec Édith Cochrane. Ensemble, elles ont d’ailleurs créé Derrière mon fauteuil et Sous mon lit, deux albums jeunesse édités chez La Bagnole et pour lesquels Isabelle Brouillette a signé les illustrations.